غلظت های در نظر گرفته شده به صورت مجزا اعمال شدند.
به منظور افزودن هر یک از تیمارها به محیط های کشت مورد نظر، ابتدا از هر یک از تیمارها استوکی تهیه شد و بر حسب غلظت مورد نظر از استوک برداشته و به محیط کشت اضافه شد. لازم به ذکر است که تهیه استوک ها به نحوی صورت گرفت که در نهایت پس از افزودن غلظت های مورد نظر به هر یک از محیط های کشت همگی دارای حجم یکسان ( ml51) باشند و در مورد گروه شاهد نیز، به همان میزان، از محیط مورد استفاده در محیط کشت برگ و ساقه (MS حاوی هورمون BAP و ۲,۴-D) اضافه شد.
۴-۲-۱- تهیه استوک محرک ها
۴-۲-۱-۱- استوک متیل جاسمونات
۱۱۴۶/۰ میلی لیتر متیل جاسمونات را در اتانول ۱۰۰ درصد حل کرده و به حجم ۲۵ میلی لیتر رسانده و پس از تنظیم pH(8/5-7/5) فیلتر شد و به منظور هر یک از غلظت های مورد نظر، از استوک برداشته شد و به هر یک از محیط های کشت اضافه شدند. به طوری که برای غلظت MJAMµ ۵۰ به میزانµl 125 از استوک برداشته شد و همین طور برای غلظت MJAMµ ۱۰۰ به میزانµl 250 برداشته می شود.

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۴-۲-۱-۲- استوک سالسیلیک اسید
۴۰۰ میلی گرم سالسیلیک اسید وزن شد و به حجم ۴۰ میلی لیتر رسید و پس از تنظیم pH(8/5-7/5) اتوکلاو شد و به منظور هر یک از غلظت های مورد نظر به شرح جدول ۳-۶، از استوک برداشته شد و به هر یک از محیط های کشت اضافه شدند. برای غلظتSA mg/50 ml culture 2 به میزانµl 200 از استوک برداشته شد و همین طور برای غلظت SA mg/50 ml culture 6 به میزانµl 400 از استوک برداشته می شود.
۴-۳- اندازه گیری میزان پروتئین کل از کالوس
محلول های مورد نیاز
بافر استخراج (Tris-HCL): برای تهیه یک لیتر از محلول استخراج، میزان ۴/۱۲۱ گرم تریس در یک لیتر آب مقطر حل کرده و اسیدیته (Ph) محلول توسط اسید کلریدریک به ۸/۶ رسانده می شود ، بدین صورت محلول بافر مورد نظر آماده میگردد.
معرف برادفورد (Bradford) : برای تهیه معرف بردفورد ، مقدار ۱۰۰ میلی گرم کوماسی برلیانت بلو G250 در ۵۰ میلی لیتر اتانول ۹۵ درصد حل شد .حداقل یکساعت عمل همزدن به منظور حل شدن کامل انجام گردید . سپس ۱۰۰ میلی لیتر اسید فسفریک ۸۵ درصد قطره قطره به محلول اضافه شود و حجم محلول کل با کمک آب مقطر به یک لیتر رسانده شد سپس محلول از کاغذ صافی واتمن (نمره یک) عبور داده شد . این معرف تا دو هفته پایدار بوده و در دمای آزمایشگاه قابل نگهداری است .اما بهتر است به مدت یک هفته مورد استفاده قرار گیرد.
روش کار
کلیه مراحل استخراج پروتیین از بافت گیاهی در دمای ۴ درجه سانتیگراد و در یخ انجام شد تا دمای بالای محیط باعث تغییر ماهیت پروتیین های نمونه و شکستن آنها نشود.

• • ابتدا ۱/۰ گرم از ریشه های فریز درایر شده توزین و در هاون چینی ساییده شد.

• • ۷ میلی لیتر بافر استخراج به نمونه ها اضافه گردید و به مدت ۳۰ ثانیه ساییده شد.

• • مواد را به یک فالکون ۱۵ میلی لیتری انتقال داده شد و به منظور استخراح بهتر پروتیین فالکون های حاوی نمونه به مدت ۲۴ ساعت در حالت سکون در سردخانه در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد.

• • فالکون ها در دمای ۴ درجه سانتیگراد به مدت ۴ دقیقه با دور ۱۶۰۰۰ سانتریفیوژ شد.

• • ۱/۰ میلی لیتر از فاز رویی برداشته شد و ۵ میلی لیتر به آن معرف بردفورد اضافه گردید و سریعا ورتکس شد و به مدت ۲۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.

• • میزان جذب نوری محلول با دستگاه اسپکتروفتو متری در طول موج ۵۹۵ نانومتر خوانده شد.

تهیه استانداردهای پروتیین
برای تهیه استانداردهای پروتیین از البومین سرم گاوی استفاده شد.بدین منظور ۱۰۰ میلی گرم ماده آلبومین گاوی در یک میلی لیتر بافر استخراج حل نموده و با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد .در این صورت محلول استوک استاندارد ppm100 بود. مقادیر ۲/۰ ، ۴/۰ ، ۶/۰، ۸/۰ و ۱ میلی لیتر برداشته شد و با آب مقطر به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد.مقدار ۵ میلی لیتر معرف برادفورد به آن افزوده و سریعا ورتکس شد . پس از ۲۵ دقیقه نگهداری در دمای ۴ درجه سانتیگراد ، میزان جذب نوری محلول حاصل با دستگاه اسپکتروفتو متری در طول موج ۵۹۵ نانومتر خوانده شد و منحنی استاندارد جهت اندازه گیری غلظت پروتیین محلول نمونه ها رسم شد .برای تهیه نمونه شاهد یا صفر کافیست که به جای عصاره پروتیینی ،۱/۰ میلی لیتر آب مقطر درون فالکون ریخته شود و به آن معرف برادفورد اضافه گردد.
۴-۴-آسکوربات پراکسیداز
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (۱۰۱۱۰۱۰۱۱ APX,EC) به روش ناکانو و اسدا (۱۹۸۷) اندازه گیری شد.مخلوط و اکنش حاوی مواد شیمیایی زیر بود :
آسکوربات ۵/۰ میلی مولار محلول در بافر فسفات پتاسیم ۱۰۰ میلی مولار ۸۵۰ میکرو لیتر
پراکسید هیدروژن ۲ میلی مولار محلول در آب دوبار تقطیر ۱۵۰ میکرو لیتر
از مخلوط واکنش بدون عصاره آنزیمی در یک کیووت کوارتز ۱ میلی لیتری به عنوان شاهد اسپکتروفتومتر در طول موج ۲۹۰ نانومتر استفاده شد. سپس ۳۰ میکرو لیتر از عصاره آنزیمی به آن اضافه شده و منحنی فعالیت آنزیم کاتالاز در مدت زمان ۱۸۰ ثانیه و بر حسب Abs/min ترسیم شد.
نحوه عمل
آنزیم اسکوربات پراکسیداز ، طبق معادله زیر پراکسید هیدروژن را با بهره گرفتن از اسکوربات به اب احیا میکند:
معادله ۴-۱
APX2AsA + H2O2 2 MDA + 2 H2O
از انجاییکه حداکثر جذب اسکوربات در طول موج ۲۹۰ نانومتر صورت میگیرد ،لذا زمانیکه آنزیم اسکوربات پرکسیداز در محیط بوده و فعالیت میکند به تدریج اسکوربات تجزیه شده و به طبع آن از میزان آسکوربات محیط کاسته شده و میزان جذب در طول موج ۲۹۰ نانومتر به تذریج کاهش می یابد. شکل ۳-۹ نحوه فعالیت آنزیم اسکوربات پراکسیداز را در یکی از نمونه های آزمایشی نشان می دهد.
۴-۴-۱- محاسبه فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز
فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز بر اساس میزان تجزیه شدن H2O2 در طول موج ۲۹۰ نانومتر و با بهره گرفتن از ضریب خاموشی ۲/۸ Mm-1 cm-1 تعیین گردید . جهت تعیین فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز نیز از رابطه ۱-۲ استفاده شد. با این تفاوت که A240 به A290 و ضریب ۲ به ۱ ( با توجه به ضریب H2O2 در معادله ۴-۱) تبدیل شد.فعالیت ویژه آنزیم آسکوربات پراکسیدازبه صورت تعداد میکرو مول H2O2 تجزیه شده در دقیقه در میلی گرم پروتئین گزارش گردید.
Activity (U/ml)= A₂₄₀ × L ×V_t × d_f / Ɛ × l × t× V_s
U واحد آنزیمی
A₂₄₀ تفاوت میزان جذب مخلوط واکنش در زمان شروع
L با توجه به ضریب پراکسید هیدروژن در معادله (۱-۲) تعیین می گردد که معادل ۴ می باشد
V_t حجم مخلوط واکنش (در این آزمایش برابر یک میلی لیتر بود).
d_f فاکتور رقیق کننده
t مدت زمان واکنش (۱ دقیقه)
V_s حجم نمونه
Ɛ ضریب خاموشی برابر ۲۶/۶ Mm^-1 cm^-1
l طول مسیر عبور نور از مخلوط واکنش (برابر یک است).
۴-۵- استخراج آرتمیزنین
به منظور استخراج آرتمیزنین از کالوس، ۲g کالوس به کمک ازت مایع پودر شد سپس در هر تیوپ حاوی نمونه پودر شده، ۵ml تولوئن اضافه شد و تحت سانتریفیوژ به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۰۰۰ rpm قرار گرفت. سپس سانیکیشن به مدت ۱۰ دقیقه روی نمونه ها انجام شد و دوباره سانتریفیوژ با دور ۴۵۰۰ rpm به مدت ۱۰ دقیقه در دمایC ˚۴ انجام شد و مایع بالایی برداشته شد و داخل لوله های آزمایش ریخته شد تا در هوای آزاد با دمای C ˚۲۰ خشک شود. نمونه ها پس از این مرحله در دمای C ˚۲۰- تا زمان انجام اسپکتروفتومتری نگه داری شد (Kim et al. 2001).
۴-۵-۱- آماده سازی
مواد خشک استخراج شده با ۴۰۰µM متانول و ۴۰۰ µl از محلول (w/v) 2% NaOH ترکیب شده و به مدت ۴۵ دقیقه در دمای C ˚۴۵ قرار دادیم. سپس تیوپ ها را روی ظرف یخ گذاشته و ۴۰۰ µl از محلول آماده سازی شده ۰/۲ M استیک اسید برای متوقف سازی واکنش به نمونه ها اضافه می شود. با اضافه کردن ۱۰۰ µl متانول حجم هر تیوپ را به ۱ml می رسانیم. نمونه ها پس از این مرحله در فریزر درایر قرار داده می شود و سپس نمونه خشک شده با ۵ ml اتانول به همراه ۰/۳ ml TFA (10% v/v) حل می شود و برای اندازه گیری آرتمیزنین، محلول بدست آمده را در سل دستگاه تزریق می کنیم. همین مراحل برای آماده سازی استاندارد نیز انجام شد (Smith et al., 1997).