(Alemzadeh & Ali ,2011 ;American Diabetes Association , 2011 Pignone et al, 2011 )
برخی مطالعات نشان می دهند که بیماری دیابت در مردان می تواند در فرایند اسپرماتوژنز اختلال ایجاد نماید (Seethalakshmi et al,1987; Sanguinetti et al, 1995). همچنین ،نشان داده شده است که این بیماری در فعالیت آندوکرینی غده هیپوفیز (خارج از بیضه ) وفعالیت آندوکرینی داخل بیضه ای اختلال ایجاد می کند.بدین صورت که در مدل های حیوانی که به طور تجربی به دیابت مبتلا شده بودند، تعداد وفعالیت سلول های لیدیگ در سطح معنی داری نسبت به حیوانات سالم کاهش پیدا می کند(Orth et al, 1979 ; Murray et al,Sanguinetti et al, 1995) علاوه براین ،بیماران مبتلا به دیابت در بسیاری از موارد با مشکل عدم توان باروری مواجه بوده وبه دنبال بررسی های روتین آزمایشگاهی مشخص شده است که تحرک اسپرم ها در این بیماران به شدت کاهش یافته است. (Murray et al,1983 ;Cameron et al, 1985).نتایج حاصل از مطالعه حاضر نشان می دهند که با القاء دیابت تجربی در مدل حیوانی موش ،توسط STZ لوله های منی ساز دچار آتروفی شده وفرایند اسپرماتوژنز دچار اختلال می شود.بدین صورت که ضرایب تمایز لوله ای ،جایگزینی اسپرماتوگونی های فعال به جای اسپرماتوگونی های غیرفعال ودر نهایت ،ضریب اسپرمیوژنز در موش های دیابتی در سطح معنی داری در مقایسه با موش های سالم کاهش می یابد.بررسی های مربوط به تعداد سلول های لیدیگ نیز نشان می دهد که تعداد این سلول ها در موش های دیابتی کاهش یافته و درصد سلول های لیدیگ هایپرتروفی شده در این گروه در مقایسه با گروه های درمانی وگروه های کنترل افزایش نشان می دهد.این در حالی است که در موش های گروه درمانی ،لوله های منی ساز آسیب کمتری را متحمل شده ودرصد لوله های با ضریب مذکور در این حیوانات به ترتیب در دوزهای mg/kg 100 و mg/kg ۵۰ افزایش قابل توجهی را نشان می دهد.این یافته ها با نتایج حاصل از بررسی های بیوشیمیایی سرم به منظور بررسی میزان سرمی تستوسترون همخوانی دارد.بدین صورت که میزان این هورمون در موش های درمان شده با ژل در مقایسه با موش های دیابتی افزایش معنی داری را نشان می دهد.در نهایت موش های درمان شده با ژل در دوز بالا توان باروری آزمایشگاهی را در مقایسه با موش های گروه دیابتی نشان می دهند.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
تغییرات وزنی وارتباط آن با دیابت
به طورکلی ،وزن بدن درجریان پیشرفت دیابت قندی کاهش می یابد (Erejuwa et al,2011).که این با نتایج تحقیق حاضرهم خوانی دارد،زیرا همان گونه که دربخش نتایج ذکرشد،در رت های دیابتی درمقایسه باگروه کنترل کاهش وزن دیده شد واین کاهش وزن در گروه های تحت تیمار باژل آلوئه ورا تاحدودی جبران شد.می توان چنین استدلال کردکه ترکیبات فلاونوئیدی موجود در ژل دارای خواص محافظت کننده سلولی وبافتی دربرابر عوامل استرس زا واکسیداتیو ناشی از رادیکال های فعال اکسیژن وجبران کننده کاهش وزن بدن در رت های دیابتی می باشد.
میزان گلوکزخون وارتباط آن با دیابت
براساس مطالعات ویافته های قبلی ،القا دیابت توسط استرپتوزوتوسین در موش های صحرایی منجر به افزایش سطح گلوکز خون می شود(Erejuwa et al,2010).که بانتایج حاصل همخوانی دارد.زیراهمانگونه که دربخش نتایج بیان شد،میزان گلوکز خون در گروه دیابتی درمقایسه باگروه کنترل افزایش معنی دار نشان داد.ژل آلوئه ورا میزان قند خون را بطور معنی داری کاهش داد.ازاین رو بهبود درسطح گلوکز سرم رت های دیابتی تحت تیمار باژل را می توان به دلیل ذخایربالای فلاونوئیدها،آلکالوئیدها وترکیبات فنلی موجود در آن دانست.
وزن بیضه وارتباط آن با دیابت
گزارش شده که اندازه بیضه به شدت با تولید اسپرم مرتبط است ، به طوری که اندازه بیضه منعکس کننده تعداد سلول های زاینده موجود درآن است.نتایج تحقیق حاضردر رت های دیابتی تیمارشده باژل افزایش معنی داری در قطرتوبول های سمنیفر وهمچنین وزن بیضه ومیزان ترشح هورمون تستوسترون را نشان داد ،همچنین معکوس نتایج مذکور را در گروه دیابتیک نشان داد.که بهبود همه ی این موارد را می توان یکی دیگرازشاخص های مطلوب اثر ترکیبات آنتی اکسیدانی این گیاه برسیستم تولیدمثلی دانست.Yong وهمکاران درسال ۲۰۰۶ گزارش کردند که آنتی اکسیدان ها می توانند سبب حفاظت DNA اسپرم وسایرمولکول های مهم در برابر تخریب سلولی تولید شده توسط استرس اکسیداتیووهمچنین بهبود کیفیت اسپرم وافزایش کارایی تولید مثلی نرشوند.همچنین مصرف آنتی اکسیدان ها ازجمله ویتامین EوC می توانند مقاومت سد خونی –بیضه ای را افزایش داده وDNA اسپرم را ازآسیب اکسیداتیوتولید شده توسط رادیکال های آزاد حفظ کند.آنتی اکسیدان ها ترکیباتی هستند که غشا های سلولی وترکیبات موجودات زنده را در مقابل اکسیدان ها حفظ می کنند.مکانیسم عمل این ترکیبات ،جمع آوری رادیکال های آزاد، واگذاری الکترون به این اکسیدان هاوجارو کردن آن هاست.
هورمون تستوسترون وارتباط آن با بیضه ها در دیابت
گزارش شده که بروز استرس اکسیداتیو سطح آنزیماتیک وغیرآنزیماتیک مهم وکلیدی را در سلول های لایدیگ کاهش می دهد ومنجر به کاهش سنتز وترشح تستوسترون می شود.(Debnath and Mandal ,2000).کاهش قابل توجه این هورمون می تواند مسئول تغییرات بافتی در بافت بیضه گردد.در این تحقیق کاهش قطرلوله ها نشان دهنده ی آتروفی این لوله هاست ،مشاهده گردید.آتروفی لوله های منی ساز نشانه اختلال مورفولوژیکی واسپرماتوژنز است.در واقع ارتباط مثبتی بین قطروفعالیت اسپرماتوژنز وجود دارد .تیمار با آلوئه ورا باعث افزایش تستوسترون گروه دیابتی وقطرلوله های منی ساز شده وآثار آتروفی لوله ها در این گروه ها مشاهده نشد.در گروه تحت درمان باژل بافت بیضه ای دارای انسجام طبیعی بوده وارتباط تنگاتنگ بین لوله های منی ساز وجود داشت ورده های مختلف سلول های جنسی در لوله ها به خوبی دیده می شد.در حالی که در گروه دیابتی افزایش بافت بینابینی وازبین رفتن انسجام بین لوله ها وآرایش نامنظم رده های مختلف سلولی کاملاً مشهود بود.در بیماری دیابت افزایش ضخامت توبول ها رخ می دهد .که در گروه درمان شده با ژل همه ی این آثاراز بین رفته بود. مطالعات نشان داده اند که در افراد دیابتی میزان هورمون علاوه برتستوسترون میزان LH و FSH در سطح قابل ملاحظه ای کاهش می یابد (کیانی فرد ،۱۳۸۹).امروزه این نکته به خوبی مشخص شده است که هورمون های مذکور در فرایند اسپرماتوژنز دخالت کرده و در سطح قابل ملاحظه ای در تحریک بافت بیضه برای تولید اسپرماتوزوآ نقش ایفا می نماید. اثر LH در مرحله اول در سلول های لیدیگ است که با وساطت آدنیلات سیکلاز عمل کرده ،استروئید زایی را تنظیم می نماید.متعاقبا مرحله محدود کننده میزان استروئیدزایی ،یعنی تبدیل کلسترول به پیشساز تستوسترون وپرگننولون راشروع می کند.تستوسترون بعد از حلقوی شدن وتبدیل شدن به استروژن ،در هیپوتالاموس عامل تنظیم ترشح LH (GnRH) با واکنش بازگشتی منفی رافعال می کند.قابل ذکر است که هدف اصلیFSH ،سلول های سرتولی است،.تحریک با FSH به اندازه کافی لازم است تا سلول های سرتولی را وادار به تقویت اسپرم زایی نماید ازسوی دیگر تستوسترون به عنوان هورمون بسیار ضروری توسط سلول های لیدیگ برای تنظیم عملکرد فیزیولوژیک سلول های سرتولی تولید می شود.
(Najafi et al, 2010) .لذا برای روشن ترشدن موضوع در این مطالعه میزان تستوسترون خون مورد ارزیابی قرار گرفت و مشخص شد که در رت های دیابتیک میزان این هورمون در سطح معنی داری کاهش یافته است.این در حالی است که در رت های درمان شده با ژل آلوئه ورا میزان هورمون مذکور در سطح معنی داری بالاتر بود.بنابراین ،در رت های درمان شده با ژل احتمالاً به دلیل پایین بودن عوارض مربوط به دیابت در غده هیپوفیز ،سطح سرمی هورمون های LH و FSH بالاتر می باشد.ازسوی دیگر در این رت ها تستوسترون بیشتری تولید می شود که به نوبه خود فعالیت فیزیولوژیک سلول های سرتولی را محافظت می نماید.این فرضیه با بالاتر بودن سطح سرمی تستوسترون در رت های درمان شده با ژل به خوبی به اثبات می رسد.بررسی های بافت شناسی میزان پراکندگی سلول های سرتولی در موش های درمان شده با ژل نیز دلیل دیگری برای اثبات این فرضیه است.زیرا تعداد سلول های سرتولی موجود در یک لوله منی ساز رت های درمان شده با ژل در مقایسه با رت های گروه دیابتی در سطح معنی داری بالاتر می باشد.بنابراین بالاتربودن سطح سرمی هورمون تستوسترون توانسته است آتروفی وازبین رفتن سلول های سرتولی در بافت بیضه موش های درمان شده با ژل قابل تشخیص است.
تعداد سلول های لیدیگ وارتباط ان با میزان تستوسترون خون
سلول های لیدیگ به عنوان مهمترین و تنها سلول های تولید کننده تستوسترون در بافت بینابینی بیضه می باشندوبررسی ها ومطالعات نشان داده اند که دیابت باعث کاهش قابل توجه تعداد سلول های لیدیگ شده ودر بسیاری از موارد این سلول ها در مدل های حیوانی دچار هایپرتروفی نیز می شوند.
(Rossi & Aeschlimann 1982; Hassan et al,1993)
نتایچ تحقیق حاضر ،یافته های قبلی را به خوبی تایید می کند.چرا که تعداد سلول های لیدیگ در رت های دیابتی در مقایسه با گروه های درمان شده با ژل در سطح معنی داری کاهش پیدا کرده است.می توان نتیجه گیری کرد که در رت های درمان شده با ژل ،تعداد سلول های لیدیگ به شکل قابل ملاحظه ای حفظ شده است.بالا بودن میزان سرمی تستوسترون این موش ها ،گواه این مدعاست.در نهایت می توان اینگونه جمع بندی نمود که احتمالا ژل آلوئه ورا می تواند با تنظیم قند خون ،عوارض دیابت را در سلول های لیدیگ کاهش دهد.در نتیجه ،این سلول ها قادر خواهند بود تستوسترون رادرسطح قابل دسترس ویا در سطحی که بتواند سلول های سرتولی را برای ادامه فعالیت فیزیولوژیک تحریک کند،سنتز نمایند.این فرضیه نیز با پایین بودن قندخون وبیشتر بودن تعداد سلول های سرتولی در رت های گروه درمان به اثبات می رسد. امروزه، مشخص شده است که سه عامل مهم در ناباروری مردان، کاهش تعداد اسپرم (Tournaye et al ,1994)، کاهش قدرت حرکتی (Mansour et al ,1996) و مرفولوژی غیر طبیعی (Pryor et al ,1994) می باشد .وجود مقادیر بالای ROSدر مایع سیمن با کاهش معنی دار غلظت اسپرم، تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم در ارتباط بوده است .(Agarwal et al ,1994) اپیدیدیم، ارگانی است که به شدت وابسته به تحریک آندروژن است، بنابراین سطح پایین تستوسترون موجود در گردش خون می تواند عملکرد آن رابصورت منفی تحت تأثیر قرار دهد و اختلال در بلوغ و کیفیت اسپرم را به همراه داشته باشد (Robaire and Hermo ,1988 ). آغاز اسپرماتوژنز در هنگام بلوغ و ادامه این روند در بالغین بستگی به میزان تستوسترون دارد. این هورمون جهت کامل شدن تقسیم میوزی و تمایز و بلوغ اسپرماتیدها در مراحل مختلف اسپرماتوژنز لازم می‌باشد(Kamel et al ,2009). همچنین ثابت شده است هنگامی که میزان تستوسترون در بافت بینابینی بیضه به کمتر از ۵% غلظت آن در گروه کنترل تنزل پیدا کند٬ تبدیل اسپرماتیدهای گرد به اشکال طویل اسپرماتید کاهش پیدا می‌کند. O Donellو همکارانش ثابت نمودند که تستوسترون برای بلوغ اسپرم ضروری است(O Donell et al ,1994). بنابراین کاهش میزان هورمون تستوسترون حاصل از تجویزSTZ ،در مطالعه ما نیز می تواند دلیلی بر کاهش بلوغ اسپرم ها در اپیدیدم باشد و این موضوع می‌تواند دلیل افزایش اسپرمهای نابالغ مشاهده شده در رنگ‌آمیزی انیلین بلو را توجیه نماید. گزارش شده است که آسیب های DNAدر اسپرم هایی که هسته آنها به طور ضعیفی متراکم شده و انتقال پروتامین-هیستون به طور کاملی انجام نگرفته وجود دارد. آسیب دیدگی در کروماتین اسپرم می تواند با محتوای نوکلئوپروتئینی غیرنرمال آن و یا با شکستگی های ساختار DNAدر ارتباط باشد و این آسیب ها از طریق رنگ آمیزی آکریدین اورنج ارزیابی می شوند(Mahi and Yanagimachi ,1975).
ارتباط تعداد سلول های سرتولی با فرایند اسپرماتوژنز
سلول های سرتولی در اتصال سلول های ژرمینال به همدیگر وکنترل فرایند اسپرماتوژنز در بافت بیضه دخالت دارندRazi et al 2011).( بررسی های بافت شناسی مطالعه اخیر نشان دادند که تعداد سلول های سرتولی در بیضه رت های دیابتیک درسطح معنی داری در مقایسه با رت های گروه درمانی کاهش یافته است. از طرفی ،لوله های منی ساز در موش های دیابتی درسطح قابل توجهی دچار ازهم گسیختگی سلول های ژرمینال شده اند.علاوه براین ،درصد لوله هایی با TDI ،RI،SPI ،MI مثبت در موش های دیابتی درسطح معنی داری پایین می باشد.بنابراین تجویز ژل آلوئه ورا باعث القاء اثرات محافظتی دربرابر دیابت شده وسلول های سرتولی بیشتری در یک لوله منی ساز باقی مانده اند.از آنجایی که سلول های سرتولی به طورمستقیم فرایند اسپرماتوژنز راکنترل می کنند،تقسیمات سلولی مربوط به فرایند اسپرماتوژنز به میزان قابل توجهی افزایش یافته است.در نتیجه ،درصد لوله های منی ساز باضرایب مثبت در این گروه ها درسطح معنی داری بالا می باشد. Salehو Agraval اظهار نموده‌اند که ارتباط بالقوه‌ای بین آسیب اکسیداتیو و عملکرد غیر طبیعی تولید مثل در بیضه وجود دارد. استرس اکسیداتیو ممکن است اکثر جرم سل ها را تخریب کند که این تخریب می‌تواند ناشی از آسیب غشاءها٬ پروتئینها٬ پلی‌ساکاریدها٬ چربی‌ها و DNA باشد که بوسیلهROS ایجاد میشود(Saleh and Agraval ,2002).یکی از فاکتورهای مهمی است که آپوپتوز در جرم سلها را القاء می کند , این مکانیزم با یافته های کائور و همکارانش قابل توجیه است که دریافتند که میزان زیاد ROS باعث از هم گسیختگی غشاءهای داخلی و خارجی میتو کندری میگردد و این تخریب غشاء باعث آزاد شدن پروتئین سیتوکروم c در میتوکندری میگردد که ممکن است منجر به فعال شدن آپوپتوز گردد.همچنین مشخص شده است که تستوسترون نقش مهمی در تکامل و تمایز سلولهای اسپرم دارد و کاهش این هورمون می تواند اختلال در فرایند اسپرماتوژنز داشته باشد و باعث کاهش لوله های TDI مثبت شده و باعث کاهش ضریب میوزی (MI) و افزایش تعداد لوله های اسپرم ساز SPI مثبت و کاهش درصد ضریب RI گردد. کاهش این هورمون باعث کاهش رده‌های اسپرماتوژنز در لوله های اسپرم ساز و در نتیجه لوله های TDI مثبت گردد. مطالعات کوبایاشی و همکارانش نشان داد که یک کاهش مستمر در تعداد سلو لهای اسپرم زنده و فعال در ارتباط با افزایش مقدار ROS وجود دارد (Kobayashi et al ,2001)
پارامترهای مربوط به اسپرم وارتباط آنها با دیابت
بررسی های بافت شناسی نشان دادند که تعداد اسپرم ها در موش های دیابتی در مقایسه باگروه های کنترل به صورت معنی داری کاهش یافته اند.از طرفی ،تعداد اسپرم ها در گروه های درمانی نسبت به گروه دیابتی درمان نشده، بیشتر بود.نکته قابل توجه این است که بررسی های مربوط به DNA integrity نشان دادند که آسیب وارده به DNA اسپرم رت های گروه دیابتی درمان نشده ، در سطح معنی داری در مقایسه با رت های درمان شده با ژل افزایش یافته است. ازطرفی ،مطالعات قبلی نشان داده اند که دیابت باعث بروز استرس اکسیداتیو در بافت های مختلف می شود.بدین صورت که میزان سنتز وتولید آنزیم های دخیل در سیستم ردوکس (سوپر اکسید د یسموتاز وگلوتاتیون پراکسیداز )را کاهش می دهد.از سوی دیگر ،یافته های قبلی نشان داده اند که فشرده شدن ژنوم اسپرم ها توسط پروتامین یک مکانیسم دفاعی در برابر استرس های اکسیداتیو می باشد که آسیب پروتامین به نوبه خود می تواند میزان آسیب وارده به DNA اسپرم ها را افزایش دهد.(Sakkas et al, 1999) علاوه بر این ،بسیاری ازعوامل می توانند باعث افزایش استرس های اکسیداتیو در بافت بیضه وبافت اپی دیدیم شوند که از جمله این موارد می توان به افزایش تعداد سلول های آتروفیک در بافت بیضه وافزایش اسپرم های غیرطبیعی در بافت اپیدیدم اشاره نمود (Agarwal et al,2008). بدین منظور ،رنگ آمیزی آنیلین بلو برای بررسی تعداد اسپرم هایی که در آنها بلوغ هسته کامل شده باشد (تغییرات مربوط به پروتامین ) صورت پذیرفت.مشاهدات این مطالعه نشان دادند که درصد اسپرم هایی که بلوغ هسته در آنها صورت نپذیرفته بود درسطح معنی داری در موش های دیابتی افزایش می یابد.باتوجه به یافته های فوق وبا در نظرگرفتن موارد ذکرشده در بالا می توان این گونه نتیجه گیری کرد که در موش های دیابتی ،ژنوم اسپرم ها به اندازه مطلوب فشرده نمی شود.در نتیجه ،DNA این اسپرم ها در برابر استرس اکسیداتیو حساس تر می باشند.این در حالی است که یافته های مطالعه های حاضر این تئوری رابه خوبی به اثبات می رساند.پایین بودن درصد اسپرم هایی با بلوغ هسته در موش های دیابتی وبالا بودن درصد اسپرم های با آسیب DNA اسپرم در این موش ها گواهی بر این فرضیه است.اما نکته ای که باید به آن توجه داشت ،تاثیر ژل آلوئه ورا در مهار عوارض ناشی از دیابت می باشد.زیرا اولاً این ژل دارای خاصیت آنتی اکسیدانتی ثابت شده استet al,2005) (Rajasekara ،در نتیجه ،استرس های ناشی از رادیکال های آزاد را درسطح قابل توجهی کاهش می دهد.ثانیاً باکاهش تعداد سلول های آتروفیک (تعداد بیشتر سلول های لیدیگ وسرتولی سالم وبالا بودن ضرایب مذکور ) توانسته است استرس اکسیداتیو رادر بافت بیضه کاهش دهد. در نتیجه ،درصد، اسپرم های سالم وطبیعی در این موش ها افزایش یافته است که به نوبه ی خود باعث کاهش تولید رادیکال های آزاد ناشی از اسپرم های غیرطبیعی در اپی دیدیم شده است.پایین بودن درصد اسپرم های با آسیب DNA در این موش ها وبالا بودن معنی دار درصد اسپرم های با بلوغ هسته، دلیلی برای اثبات این فرضیه می باشند.مطالعات قبلی نشان داده اند که استرس اکسیداتیو درسطح قابل ملاحظه ای به غشا اسپرم ها آسیب وارد می کند(Duru et al, 2000)، به منظور روشن شدن این موضوع ،رنگ آمیزی ائوزین نگروزین صورت پذیرفت ومشاهدات نشان دادند که در موش های دیابتی ،درصد اسپرم های مرده در سطح معنی داری در مقایسه با موش های درمان شده با ژل آلوئه ورا افزایش یافته است.بنابراین،ژل آلوئه ورا احتمالا با مهار استرس های اکسیداتیو،شدت آسیب وارده به غشاء اسپرم ها را کاهش داده است.بنابراین ،درصد اسپرم های مرده در این حیوانات در سطح معنی داری کاهش یافته است.ارتباط بین افزایش استرس اکسیداتیو و کاهش تحرک اسپرم ها را می توان با بهره گرفتن از دو تئوری توجیه نمود:اول اینکه فرایندهای پاتولوژیک متوالی ،با کاهش فسفریلاسیون پروتئین های آکسونمی منجر به کاهش تحرک اسپرم ها می شوند.دوم اینکه رادیکال های آزاد مانند H202 قادرند متعاقب فسفریلاسیون غشاء اسپرم ها وارد سیتوزول آنها شده وفعالیت آنزیم G6PDH را کاهش دهند(Twigg et al, 1998). بررسی های مربوط به تحرک اسپرم ها نشان داد که این پارامتر در موش های دیابتی در سطح معنی داری کاهش می یابد وبرعکس .در موش های درمان شده با ژل آلوئه ورا در سطح معنی داری افزایش می یابد.لذا می توان این نقصان رابه نفوذ رادیکال های آزاد به درون اسپرم ها نسبت داد.به این صورت که غشاء اسپرم ها در برابر رادیکال های آزاد وهمچنین پراکسیداسیون ناشی از استرس های گوناگون بسیار حساس است.زیرا در ساختار غشاء اسپرم ها چربی های غیراشباع حاوی د-کوکسو-هگزاآنوئیک اسید و ۶ باند دوتایی به ازای یک مولکول اسید چرب غیراشباع وجود دارد.(Duru et al, 2000)باتوجه به یافته ها وتوضیحات فوق می توان این گونه استنباط نمود که دیابت با سوق دادن شرایط فیزیولوژیک دفاعی به سمت استرس های اکسیداتیو و آسیب رسانی به غشاء پلاسمایی اسپرم ها باعث کاهش توان حرکتی اسپرم ها می شود.این نکته نیز با مشاهده افزایش درصد اسپرم هایی که سیتوپلاسم رنگ شده با ائوزین را متعاقب رنگ آمیزی با ائوزین –نگروزین نشان می دادند ،به خوبی قابل درک است.
ارزیابی بیوشیمیایی
ارزیابی بیوشیمیایی که به منظور آشکارساختن مکانیسم ایجاد دیابت توسط داروی استرپتوزوسین صورت پذیرفت،نشان داد که افزایش معنی داری در سطح مالون دی آلدئید وکاهش معنی داری در میزان ظرفیت آنتی اکسیدانتی تام بیضه موش های صحرایی نر دیابتی شده حاصل گردید.این نتایج نقش داروی استرپتوروسین وبه تبع آن دیابت را در تولید رادیکال های آزاد فعال اکسیژن ،کاهش میزان آنتی اکسیدانت ها ونیز ایجاد پراکسیداسیون لیپیدی در بافت بیضه که پیشتر گزارش شده بودرا تایید وجایگا ه استرس اکسیداتیو و اختلالات بیوشیمیایی وفیزیولوژیک ناشی از آن را در روند بروز عوارض این بیماری از پیش مد نظرقرار داد.کاتالاز یک هموپروتئین با فعالیت پراکسیدازی است که در بافت های پستانداران عمل سمیت زدایی رادیکال های آزاد را برعهده دارد وکمبود آن با عوارض اکسیداتیو دیابت همراه است.نتایج این پژوهش نشان می دهد که فعالیت آنزیم کاتالاز در موش های دیابتی در مقایسه باسایرگروه ها کاهش قابل ملاحظه ای پیدا کرده است که این نتایج با نتایج Erejuwa et al مطابقت داشت.وگروه های تحت تیمارافزایش معنی دار در فعالیت کاتالاز رانشان دادند.آلوئه ورا حاوی آنتی اکسیدان های مختلف ازجمله پلی فنول وفلاونوئید است .مطالعات نشان داده اند مه استفاده از فلاونوئیدها فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی ازجمله آنزیم کاتالاز را افزایش می دهد. (Erejwa et al 2010).درموش دیابتی تحت تیمار با ژل ا،افزایش فعالیت کاتالاز مشاهده شد که این آثارسودمند را می توان به خاصیت آنتی اکسیدانی وتقویت کنندگی سیستم حذف رادیکال های آزاد اکسیژن نسبت داد.درجه پراکسیداسیون لیپیدها ،با بالا رفتن سطح برخی مارکرها ازجمله مالون دی آلدئید (محصول نهایی پراکسیداسیون اسیدهای چرب تعیین می شود.که این میزان در گرو ههای تحت درمان به طور معنی داری متفاوت بود.ژل آلوئه ورا ازطریق کاهش دادن سطح محصولات نهایی گلیکوزیلاسیون موجب کاهش استرس اکسیداتیو ونشانه های آن ازجمله مالود دی آلدئید در نواحی بافتی موش های دیابتی می گردد.که این یافته با یافته های Rajasekaran. مطابقت دارد.ایشان وهمکارانشان (۲۰۰۶)،نشان دادند که استرس اکسیداتیو ازطریق رادیکا ل های آزاد سبب پیشرفت عوارض دیابت در دراز مدت،ازجمله در مویرگ ها واختلال در عملکرد آنها می شود( Rajasekaran et al, 2006) افزایش MDA در بافت بیضه ممکن است ناشی از تولید ROS توسط هورمونهای گیاهی تنظیم کننده رشد باشد که منجر به تغییرات پاتوفیزیولوژیک میگردد(Solimon et al ,2010). ROS به اجزاء سلولی از جمله DNA آسیب می‌رساند (Bhalla and Dhawan ,2009). مولکولهای مالون‌دی‌آلدئید با نفوذ به درون ساختار غشاءسلولی موجب عدم تقارن در توزیع اجزاء لیپیدی غشاء میشود، علاوه بر این با ایجاد پیوندهای محکم باDNA سلول، موجب بروز صدمات و شکستگیهایی در کروموزوم میشود (Wu et al 1989). Dangi درسال ۲۰۱۱ بیان کرده است که مکانیسم آسیب DNA توسط بیماری دیابت مربوط به افزایش مارکرهای افزایش استرس اکسیداتیو مانند ROS و گلوتاتیون و افزایش پتانسیل غشاء میتوکندریای و فعالیت caspase-3 می باشد. نتایج حاصل از مطالعه ما همسو با تجربیات فوق نشان می دهد میزان MDA در بافت بیضه افزایش یافته است. که این خود می تواند دلیل آسیب به DNA اسپرم و رنگ گرفتن اسپرم ها به رنگ قرمز نارنجی توسط رنگ آمیزی اکریدین اورنج باشد. موافق با نتایج Eisha، در آزمایش ما نیز گروه های دیابتی افزایش معنی داری در میزان اسپرم های نابالغ و دارای DNAی آسیب دیده نشان می دهند (Abou-Eisha ,2001). بر اساس نتایج حاصل از مطالعه با رنگ آمیزی آکریدین اورنج نشان می‌دهد که در رتهای دیابتی شده٬ تعداد اسپرمها با DNA آنورمال و دناتوره افزایش معنی‌دار پیدا می‌کند. مطالعات قبلی نشان داده است در مردانی که قدرت باروری انها کمتر است٬ اسپرمهایی که دارای DNA و کروماتین نرمال نیستند بیشتر است (Irvin et al ,2000). در سال ۱۹۸۰ Evenson گزارش نمود که اشخاصی که بیش از ۳۰% اسپرم آنها دارای آسیب DNA هستند بایستی به عنوان افراد غیربارور در نظر گرفت (Evenson and Jost ,1999). گزارشهای فراوانی در مورد رابطه ROS با میزان اسپرم های ناسالم، مورفولوژی غیر طبیعی اسپرم ها و کاهش نفوذ اسپرم به اووسیت وجود دارد ( Aitekin and Clarkson ,1987). مطالعات نشان داده است که افزایش ROSبا اختلال در ساختار DNA، کاهش درصد اسپر مهای زنده و عدم اتصال اسپرم به سطح تخمک همراه است و باعث ناباروری در مردان میشود .پراکسیداسیون چربی موجب ناهنجاری در قطعه میانی اسپرم و از دست دادن ظرفیت آکروزوم در لقاح میگردد (Aitekin et al ,1987)اسپرم نسبت به اکسیژن حاصل از پراکسیداسیون چربی حساس بوده به طوری که پراکسیداسیون چربی ها موجب تخریب غشاء و کاهش باروری اسپرم میشود (Ravie and Lake ,1985).افزایش مقدار آنزیم مالون‌دی‌آلدئید باعث اختلال در نظم و فعالیت غشاء سلولی میشود به طوری که روندهای انتقال یونی و گرادیان غلظتی یو نها در دو طرف غشاء و همچنین انتقال پیامبرهای شیمیایی نیز مختل میگردد .(Sharma and Agrawal ,1996) ارتباط بین وجود مقادیر بالای ROS در مایع منی و کاهش معنی‌دار غلظت اسپرم ثابت شده است (Agarwal et al,1994).
ارتباط بین کیفیت پایین اسپرم ها وتوان باروری آزمایشگاهی
گزارشات متعددی گویای این نکته هستند که درصورت بروز هرگونه اختلال درفرایند بلوغ داخل اپیدیدیمی اسپرم ها،این سلول ها درتوان بارورسازی دچارمشکل می شوند. (Evenson, 1999)کسب قابلیت های لازم برای تحرک ،ظرفیت یابی ونفوذ به درون پرده شفاف اووسیت ها ازجمله مواردی هستند که اسپرم ها در طی عبور ازاپیدیدیم،آنها راکسب می کنند (Suzuki & Sofikitis ,1999). بنابراین بااستناد به افزایش تعداد اسپرم هایی که ازلحاظ بسته بندی DNA دچارمشکل بودند وافزایش آن دسته ازاسپرم هایی که ازلحاظ مرفولوژیک ،نابالغ ویاغیرطبیعی بودند، می توان این گونه نتیجه گیری کرد که احتمالاً دیابت در بلوغ داخل اپیدیدیمی اسپرم ها اختلال ایجاد می کند.لذا اسپرم های نابالغ وغیرطبیعی افزایش یافته ودر نهایت ،توان باروری کاهش می یابد. این در حالی است که با توجه به موارد بالا ،ژل آلوئه ورا این عوارض را به شکل قابل ملاحظه ای کاهش می دهد وباعث افزایش توان باروری آزمایشگاهی موش های درمان شده با ژل می شود.ازسوی دیگر ،سلامت غشاء اسپرم ها نیز دارای اهمیت است می باشد.به این صورت که در غشاء سالم ،اسیدهای چرب غیراشباع در بوجود آمدن خاصیت روان وشناور اسپرم در محیط واژن دارای اهمیت هستند(Twigg et al,1998;Agrawal et al,2008). همچنین در صورت بروز هرگونه آسیب در باندهای دوتایی این اسیدهای چرب ،غشاء اسپرم ها دیگر قادر نخواهند بود که در واکنش های نفوذ غشایی درحین مواجهه با اووسیت شرکت نمایند (Holstein et al, 1996)بنابراین ،می توان نتیجه گیری کردکه متعاقب آسیب های وارده به غشاء اسپرم وهمچنین ازبین رفتن خاصیت شناوری اسپرم ها ،توان باروری آنها نیز کاهش یافته وباکاهش این آسیب ها (توسط درمان با ژل آلوئه ورا) توان باروری آزمایشگاهی افزایش می یابد.براساس یافته های برخی ازمحققین ،درصد باروری اووسیت ها موفقیت آزمایشگاهی ،ارتباط منفی با آسیب به DNA اسپرم ها درمسیر اسپرمیوژنز دارد.به خوبی مشخص شده است که اسپرم های با DNA آسیب دیده قادر نیستند تا اووسیت ها را در شرایط آزمایشگاهی بارور سازند.مشاهدات ما نشان دادند که اسپرم های موش های دیابتی از درصد باروری بسیار پایینی برخوردارند. زورن و همکاران نشان دادند، لقاح و باروری در روش IVF با میزان ROS رابطه معکوس دارد. در نمونه های منی که میزان ROS بالایی دارند، بطور معنی داری تعداد کمتری از جنینها( که با بهره گرفتن از روش ICSI به دست می آید) به مرحله مرولا و بلاستوسیست میرسند. میزان بالای ROS در منی هم منجر به اختلال در توانایی بارورری اسپرم و هم کاهش میزان باروری در IVF به روش ICSI می شود (Zorn et al ,2003). گزارش شده است که ROS باعث القائ شکستگی در رشته DNA می شود.افزایش ۴ برابری در شکستگی DNAی هسته در اسپرماتوزوآهایی که در معرض ROS قرار گرفته اند مشاهده می شود .ضایعات DNAی هسته موجب ایست تکامل جنین در آزمایشگاه می شود (Kowaltowski and Vercesi ,1999). کاهش باروری ممکن است ناشی از افزایش تعداد اسپرمهای نابالغ باشد. با توجه به اینکه در مطالعه حاضر هم MDA افزایش پیدا می‌کند و هم اینکه در رنگ آمیزی اکریدین اورنج آسیب DNA مشاهده شد بنابراین در گروه های دیابتی کاهش در تعداد اووسیتهای تبدیل شده به زیگوت دیده شد. همچنین کاهش معنی‌داری در تعداد زیگوتهای تبدیل شده به جنین دو سلولی و نیز جنین های تبدیل شده به بلاستوسیست مشاهده می شود.. مولکولهای مالون‌دی‌آلدئید با نفوذ به درون ساختار غشاءسلول موجب عدم تقارن در توزیع اجزاء لیپیدی غشاء میشود. علاوه بر این با ایجاد پیوندهای محکم با DNA سلول، موجب بروز صدمات و شکستگیهایی در کروموزوم می شود. همچنین وجود رابطه معکوس بین غلظت MDA و میزان چسبندگی اسپرم به سلول تخمک توسط ایتکن و همکارانش به اثبات رسیده است ( Aitekin et al ,1987). قبلا گزارش شده است که ROS آکسونم و سیتواسکلتون اسپرماتوزوئید را تغییر می‌دهد و در نتیجه باعث کاهش تحرک اسپرم و مهار ادغام اسپرم-اووسیت میگردد که که این موضوع به نوبه خود باعث کاهش باروری میگردد (Eid ,2008). هماده گزارشکرده است که DNA غیر متراکم اسپرم قادر به لقاح تخمک نمی باشد . در مطالعات اخیر ثابت شده است که DNA نابالغ، حتی در صورتی که مستقیماً به داخل تخمک تزریق شود نیز قادر به لقاح نمی باشد. نقص در عملکرد ژنها ، سنتز پروتئینها و اختلال در انجام واکنش های بیوشیمیایی درگیر در فرایند متراکم شدن DNAاسپرم از تئوری های پیشنهادی برای این پدیده از دیدگاه ملکولی است (Hammadeh et al ,2001).
دیابت ویافته های مورفولوژیکی بیضه
دیابت تغییرات بافتی بیضه ای را ازطریق ایجاد مرگ سلولی آپوپتوزی وآتروفی توبول های سمنی فروس ،کاهش قطر توبول وکاهش مجموعه های سلولی اسپرماتوژنیک ایجاد می کند.
آتروفی توبول های سمنی فروس وکاهش سلول های اسپرماتوژنیک نشانه های مورفولوژیک اختلال دراسپرماتوژنز هستند.(Cameron et al,1985) .موتاسیون DNA میتوکندری در بافت های افراد دیابتی گزارش شده است که نشان دهنده آسیب میتوکندری مرتبط با استرس اکسیداتیو است. دیابت اثرهای عملکردی وساختاری متنوع برسیستم تولیدمثل نر دارد.کاهش تولید تستوسترون ،تحلیل غدد ضمیمه تولیدمثلی ،کاهش میل جنسی و رفتارهای جنسی رادر افرادمبتلا به دیابت گزارش شده است.دیابت همچنین براسپرماتوژنز تاثیر می گذارد(Soudamani et al 2006) .کیفیت پایین مایع سمینال در این افراد نیز گزارش شده که شامل کاهش حرکات اسپرم وکاهش شمار اسپرم وافزایش اسپرم های ناهنجاراست.(Vignon et al 1991).بنابراین طبق نتایج به دست آمده آلوئه ورا باعث حفاظت بافت وآسیب های ناشی از دیابت می شود.
۴-۱۲-نتیجه گیری
براساس نتایج حاصل از این تحقیق می توان این گونه نتیجه گیری کرد که دیابت فرآیندهای اسپرماتوژنز واسپرمیوژنز را تحت تاثیر قرار می دهد.ازطرفی با ایجاد استرس اکسیداتیو باعث آسیب اسپرم شده و در نهایت منجر به کاهش باروری می شود.ژل آلوئه ورا با دارا بودن خاصیت آنتی اکسیدانتی ،قابلیت کاهش قند خون ، آسیب های ناشی از دیابت را در بافت بیضه و اسپرم مهار کرده و منجر به افزایش قابلیت باروری می شود.
۴-۱۳-پیشنهادات
درادامه این تحقیق مواردزیرپیشنهاد می شوند
۱-بررسی توانایی تستوسترون تجویزی همراه باداروی آنتی اکسیدانتی درمحدود نمودن آسیب های ناشی ازدیابت
۲-بررسی تاثیردیابت بر روند ظرفیت گیری اسپرم ها وحفظ شکل کامل گیرنده های غشایی اسپرم ها متعاقب بروز دیابت
۳-بررسی تاثیر دیابت برمیزان بیان نیتریت اکسید در بافت بیضه واثرحفاظتی ژل آلوئه ورا
۴-بررسی تاثیر دیابت برکربوکسیلاسیون پروتئین ها در بافت بیضه واثرحفاظتی ژل آلوئه ورا
abstract
Title of thesis: The preservative effects of Aloe vera gel on functional and structural changes in STZ-induced diabetic male rat reproductive systems
Abstract:
Diabetes is a metabolic disorder with an impairment on insulin secretion and/or with tissue inability to respond to insulin. This disease in long period can damage the testis tissue and reduce the semen quality and decrease the serum testosterone level. Therefore it can impair the male fertility potential. Recently different herbal therapeutic treatment for protection of diabetes and its pathologic effects are used. The aim of this study was to evaluate effects of Aloe vera gel (AVG) on the testes tissue include: The number of lymphocytes and Leydig cells, and evaluation sperm count, sperm viability (By Eosin-Nigrosin stain), sperm maturity (by Aniline Blue stain), DNA damages in sperm chromatin (by Acridine Orange stain) and sperm motility in adult male rats. Finally, to study the effects of AVG on diabetes induced detrimental to analyze the in-vitro fertilizing ability of the AVG-treated diabetic rat. Additionally the potential impact of AVG on tissue malondealdehyde (MDA),FRAP and catalase ratio were analyzed in histological sections of testis. Moreover, serum concentrations of testosterone, was measured. To follow-up present study 42 mature male rat were divided equally into 6 groups. These groups were control,AVG 50,AVG 100, diabetic (induced by STZ, 60mg/kg), diabetic+AVG 50 (induced by STZ, 50 mg/kg +AVG, 50mg/kg, every day for 56 days by gavages) and diabetic+AVG100 (induced by STZ, 60mg/kg +AVG, 100 mg/kg, every day for 56 days by gavages). The animals in control and diabetic groups received normal-saline by gavages orally. After 56 days, all animals were sacrificed. The sperm samples were collected from caudal epididymis in order to evaluate the sperm parameters and as well to perform the in-vitro fertilizing (IVF) analyses. Comparing seminiferous tubules diameter between test groups revealed that, the tubules diameter remarkably (P<0.05) reduced in diabetic groups, while tubular diameter in D+AVG -administrated animals was remarkably higher than diabetic group and manifested similar to control-sham tubules diameter. The leydig cells number/ mm2 of the connective tissue and the sertoli cells number/one tubule significantly (P<0.05) decreased in diabetic animals in comparison to D+AVG -treated and control groups. Light microscopic analyses for sperm parameters demonstrated that, the sperms motility and viability remarkably (P<0.05) increased in D+AVG -administrated groups in comparison to diabetic group of animals. the sperm count was decreased in diabetic group,Moreover the percentage of sperm with DNA disintegrity, nuclear immaturity, were significantly (P<0.05) increased in diabetic group in comparison to D+AVG –treated rat. The animals in D+AVG -administrated groups (especially those in D+AVG100) showed remarkably (P<0.05) higher fertilizing success. In D+AVGtreated groups compared to diabetic group, significantly (P<0.05) higher percentage of fertilized oocytes developed toward blastocyst stage and remarkably lower percentage of embryos blocked in different stages of embryo development. Hormonal analyses for testosterone revealed that, the serum level of testosterone significantly (P<0.05) decreased in diabetic group in comparison to D+AVG -administrated group (especially D+AVG100). The results of this study revealed that, the diabetes damages the spermatogenesis and spermiogenesis processes. Furthermore it leads to severe reduction in serum level of testosterone by significantly decreasing the leydig cells number/ mm2 of the interstitial connective tissue. Ultimately by decreasing the semen quality diabetes reduces fertilizing success. Meanwhile, the AVG prevents diabetes-induced detrimental effects by antioxidative feature and its ability in reducing blood glucose. Thus the AVG can be considered as an appropriative compound in order to protect testicular tissue and sperms from diabetesdependent damages.
Key words: Diabetes, Aloe vera gel, Testicles, Spermatogenesis,
Sperms, Testosterone, In-Vitro fertilizing
اسمیت د .(۲۰۰۱). اورولوژی عمومی ،(ترجمه ،حمید رضا شامخی ،محمدرضا جوانشیر،مهدی شاهوردی علمداری )،صفحات :۷۹۰-۷۴۷ (انتشارات سماط).
بختی م،صالحی م،اشرفی م،دانشگر ن .(۱۳۸۹) .شناخت،پیشگیری،کنترل ودرمان بیماری دیابت ،صفحات :۲۰۵-۲۰۳(انتشارات کیاراد).
جان کوئیرا ل، کارنیرو خ. (۲۰۰۵). بافت شناسی پایه (ترجمه مهدی بهادری)ویرایش یازدهم ،صفحات :۵۲۳-۵۱۰(انتشارات ارجمند).
رجحان م .(۱۳۷۶)،بافت شناسی پایه (بافت شناسی پزشکی)،صفحات :۷۱۳-۷۱۲(انتشارات چهر)
رضازاده،م .(۱۳۸۱). تزریق درون سیتوپلاسمی اسپرم، چاپ اول، فصل سوم، صفحات:۶۱-۲۳( انتشارات بشری به سفارش پژوهشکده رویان).
زرگری،ع. (۱۳۷۰).گیاهان دارویی،جلدپنجم،صفحات:۱۶۹-۷۹(انتشارات دانشگاه تهران).
صمصام شریعت،ه (۱۳۷۱)عصاره گیری واستخراج مواد مؤثرگیاهان دارویی وروش های شناسایی وارزشیابی آن ها،صفحات:۱۹-۱۲(انتشارات مانی).
فدراسیون جهانی دیابت،انجمن بین المللی نفرولوژی(۱۳۸۳)دیابت وبیماری کلیه(ترجمه شهین یاراحمدی)صفحات:۱۳-۳(انتشارات بیژن)
قراگزلو م،عراقچیان م،شاه طاهری م ،رادمهرب .(۱۳۸۵).حیوانات آزمایشگاهی (بیولوژی،آناتومی ،کاربرد وپاتولوژی)،صفحات:۱۳-۳(انتشارات بیژن).
کیانی فرد د. (۱۳۸۹).مطالعات بافت شناسی بیضه،ایمونوهیستوشیمی ماکروفاژهای بیضه ای،فوق ریزبینی سلول های رده اسپرماتوژنز وآنالیزاسپرم در رت های بالغ دیابتی،پایان نامه شماره۱۵۹-۱،صفحات ۸۷-۸۸(دانشکده دامپزشکی ارومیه).
